MATA KULIAH       : FITOKIMIA

1. Jelaskan dalam jalur biosintesis triterpenoid, identifikasilah faktor-faktor penting yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid dalam kuantitas yang banyak.

Jawab :

Triterpenoid terdiri dari tiga unit isopren, untuk dapat mengetahui jalur biosintesis triterpenoid, terlebih dahulu harus diketahui bagaimana jalur biosintesis terpenoid yang menghasilkan isopren-isopren penyusun triterpenoid.

Biosintesis terpenoid melalui jalur asam mevalonat, pertama reaksi antara asam asetat dengan enzim CoA-SH membentuk molekul asetil-koenzim A (asetil-CoA), lalu dilanjutkan dengan reaksi kondensasi dua molekul asetil-koenzim A (asetil-CoA) membentuk asetoasetil-CoA dengan katalis enzim asetil-CoA asetiltransferase (tiolase). Kemudian asetoasetil-CoA berkondensasi lagi dengan satu unit asetil-CoA lainnya membentuk molekul β-hidroksi-β-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) dengan katalis enzim HMG-CoA sintase. Selanjutnya reaksi reduksi HMG-CoA oleh NADPH dengan katalis enzim HMG-CoA reduktase menghasilkan asam mevalonat. Selanjutnya asam mevalonat mengalami fosforilasi oleh ATP menjadi asam-5-pirofosfat-3-fosfomevalonat dengan bantuan enzim mevalonat kinase dan enzim fosfomevalonat kinase. Lalu asam-5-pirofosfat-3-fosfomevalonat mengalami dekarboksilasi menjadi isopentenilpirofosfat (IPP) dengan enzim pirofosfat mevalonat dekarboksilase, proses selanjutnya yaitu mengubah isopentenilpirofosfat (IPP) menjadi dimetilalilpirofosfat (DMAPP) dengan bantuan enzim IPP isomerase. IPP dan DMAPP berkondensasi secara berturut membentuk geranilpirofosfat (GPP) dengan bantuan enzim geranilpirofosfat sintase dan farnesilpirofosfat (FPP) dengan bantuan enzim farnesilpirofosfat sintase dan geranil-geranil pirofosfat (GGPP) dengan bantuan enzim geranil-geranil pirofosfat sintase. Selanjutnya berturut-turut menjadi monoterpena (10 C), seskuiterpena (15 C), dan diterpena (20 C).

Jalur biosintesis triterpenoid

Pada jalur biosintesis triterpenoid, farnesilpiroposfat  (15 C) yang dihasilkan pada biosintesis terpenoid mengalami reaksi oksidasi menjadi farnesildifosfat, selanjutnya dua molekul farnesildifosfat berkondensasi dengan ujung difosfat untuk membentuk pra skualen difosfat yang melibatkan reaksi eliminasi pirofosfat kemudian diikuti dengan reduksi NADPH yang disertai dengan reaksi eliminasi radikal pirofosfat sisanya sehingga dihasilkan skualen. Selanjutnya skualen mengalami siklisasi menghasilkan lanosterol, lalu lanosterol akan melepaskan tiga gugus metil nya sehingga membentuk kolesterol. 

Faktor-faktor yang menentukan hasil triterpenoid dalam jumlah banyak yaitu bila kerja enzim β-hidroksi-β-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reduktase dalam hal ini enzim 3-hidroksi-3metilglutaril-CoA reduktase dihambat, maka kolesterol yang dibentuk dalam jumlah yang sedikit. Enzim tersebut sangat berperan dalam pembentukan kolesterol, dimana enzim tersebut dapat membentuk unit isopren-isopren penyusun triterpenoid (kolesterol).

 

  2. Jelaskan dalam penentuan struktur flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum IR dan NMR. Berikan dengan contoh sekurang-kurangnya dua struktur yang berbeda.

Jawab : 

Prinsip kerja spektroskopi IR yaitu berdasarkan vibrasi molekul atau getaran ikatan atom. Atom-atom di dalam molekul tidak  dalam keadaan diam, akan tetapi biasanya terjadi peristiwa vibrasi (getaran). Hal ini bergantung pada atom-atom dan kekuatan ikatan yang menghubungkannya. Vibrasi molekul sangat khas untuk suatu molekul tertentu dan biasanya disebut vibrasi finger print ( getaran daerah sidik jari). Vibrasi molekul dapat digolongkan atas dua golongan besar, yaitu :

1. Vibrasi Regangan (Streching)

2. Vibrasi Bengkokan (Bending)

Struktur flavonoid

Dari struktur diatas dapat diketahui bahwa flavonoid terdiri dari ikatan-ikatan sebagai berikut:

Ikatan rangkap karbon – karbon C=C (aromatik)

Ikatan rangkap karbon – oksigen C=O (keton)

Ikatan tunggal karbon – oksigen C–O (eter)

Ikatan tunggal karbon –  hidrogen C – H (aromatik)

Ikatan tunggal oksigen – hidrogen O – H (fenol)

Dari ikatan-ikatan yang terdapat pada struktur flavonoid dapat diketahui kekhasan signal dan intensitas serapan pada spektrum IR:

Ikatan rangkap karbon – karbon C=C : mempunyai penyerapan cahaya pada daerah serapan  1500 – 1600 cm^-1 dengan intensitas serapan sedang dan tajam.

Ikatan rangkap karbon – oksigen C=O : merupakan salah satu penyerapan yang sangat berguna, yang bisa ditemukan pada daerah sekitar 1705 – 1725  cm^-1 dengan intensitas serapan kuat dan tajam.

Ikatan tunggal karbon – oksigen C–O : mempunyai penyerapan dalam ‘daerah sidik jari’, yang yang bisa ditemukan pada daerah sekitar antara 1000 – 1300cm^-1,dengan intensitas serapan lemah dan melebar.

Ikatan tunggal karbon –  hidrogen C – H  : mempunyai penyerapan cahaya yang terjadi pada daerah serapan 3050-3150 cm^-1, dengan intensitas serapan lemah dan tajam akibat rentangan C – H aromatik.

Ikatan tunggal oksigen – hidrogen O – H : menyerap sinar yang berbeda-beda, tergantung pada kondisi lingkungannya. Ikatan O – H ini akan sangat mudah dikenali dalam sebuah asam karena akan menghasilkan intensitas serapan lebar atau lembah yang sangat luas pada daerah sekitar 3200-3500 cm^-1.

Prinsip Kerja Spektroskopi NMR yaitu berdasarkan pada penyerapan energi oleh partikel yang sedang berputar di dalam medan magnet yang kuat. Energi yang dipakai dalam pengukuran dengan metode ini berada pada daerah gelombang radio 75-0,5 m atau pada frekuensi 4-600 MHz, yang bergantung pada jenis inti yang akan  diukur.  Inti yang dapat diukur dengan NMR yaitu :

a. Bentuk bulat

b. Berputar

c. Bilangan kuantum spin = ½

Kekhasan signal NMR, spektroskopi 1H-NMR memberikan informasi mengenai posisi H pada struktur senyawa sedangkan spektroskopi 13C-NMR memberikan informasi mengenai struktur karbon dalam sebuah molekul yang dapat dilihat dari geseran kimianya.  Suatu molekul terdiri dari beberapa atom dan setiap atom itu terdiri dari inti atom. Setiap inti atom berorientasi pada medan magnet yang kuat. Setiap proton di dalam molekul yang memiliki sifat kimia berbeda akan memberikan garis-garis resonansi orientasi magnet yang berbeda. Resonansi terjadi akibat perubahan proton dari satu arah (spin searah) ke arah lain (spin berlawanan) oleh gelombang radio. Inti yang memiliki jumlah proton dan neutron keduanya genap, tidak mempunyai momentum sudut putar dengan I=0 dan tidak menunjukkan sifat magnetik sehingga tidak memberikan sinyal NMR. Sedangkan  Inti yang bersifat magnetik (I>0) pada umumnya berinteraksi dengan medan magnet luar dan menyesuiakan interaksinya dengan medan magnet luar kemudian menyesuaikan orientasinya dengan tingkat-tingkat energi yang sesuai sehingga memunculkan sinyal. Sinyal-sinyal tersebut muncul karena adanya perbedaan  dari proton-proton yang terdapat pada suatu molekul, banyaknya proton dari setiap proton yang ada dinamakan intensitas sinyal. Sinyal-sinyal tersebut akan terpecah menjadi beberapa puncak. Jadi pada spektroskopi 13C-NMR, sinyal-sinyal dari setiap atom karbon yang menyusun suatu molekul akan terbaca satu per satu. Atom karbon yang mempunyai interaksi yang kuat terhadap medan magnet akan muncul terlebih dahulu pada daerah serapan sedangkan atom karbon  yang mempunyai interaksi yang lemah terhadap medan magnet akan muncul belakangan pada daerah serapan dan menunjukkan intensitas yang tajam pada setiap kemunculan signal. Sedangkan pada spektroskopi 1H-NMR, menunjukkan sinyal-sinyal dari atom H yang terikat dan menyusun suatu molekul, sinyal atom H yang terikat dengan atom O pada benzena akan muncul terlebih dahulu kemudian akan muncul sinyal dari atom H yang terikat dengan atom C pada benzena dan sinyal yang terakhir muncul yaitu atom H yang terikat dengan atom O pada benzena yang memiliki ikatan rangkap dengan atom O lain. Semua sinyal yang muncul mempunyai intensitas tajam. 

Contoh flavonoid

Quercetin

Spektrum IR Quercetin

Spektrum NMR Quercetin

Catechin

Spektrum IR Catechin

Spektrum NMR Catechin

 
3. Dalam isolasi alkaloid, pada tahap awal dibutuhkan kondisi asam atau basa. Jelaskan dasar penggunaan reagen tersebut, dan berikan contohnya sekurang-kurangnya tiga macam alkaloid.

Jawab :

Pada tahap awal isolasi alkaloid digunakan pelarut petroleum eter, dimana kebanyakan alkaloid tidak larut dalam petroleum eter membentuk residu. Lalu residu tersebut ditambahkan ethanol 95%. Kebanyakan alkaloid yang terdapat dalam tanaman sebagai garam organik, dan garam-garam tersebut larut dalam ethanol 95% (dalam suasana asam).  Larutan kemudian diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat etanol dan residu, Residu tersebut masih mengandung asam dan petroleum eter, selanjutnya residu dipisahkan. Maka akan terpisah dalam bentuk endapan dan larutan, endapan tersebut merupakan petroleum eter sedangkan larutan tersebut merupakan larutan basa (garam-garam organik yang larut dalam alkohol). Kemudian larutan basa tersebut diekstrak dengan pelarut kloroform atau etil asetat dan dikeringkan dengan Na₂SO_4, lalu disaring selanjutnya dikeringkan untuk mendapatkan sisa alkaloid kotor. Jadi secara keseluruhan proses isolasi alkaloid yaitu alkaloid ditarik dalam bentuk garamnya dengan alkohol (etanol 95%) dalam suasana asam lalu dipisahkan dalam bentuk basanya kemudian ditarik dengan pelarut organik.

Contoh alkaloid :

Kafein

Nikotin

Capsaicin

      4. Jelaskan keterkaitan diantara biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam . Berikan contohnya.

Jawab :

Biosintesis merupakan cara memeriksa mekanisme produksi suatu senyawa dalam organisme asalnya yang identik dengan mekanisme reaksi, dari mekanisme tersebut dapat diketahui pembentukkan suatu senyawa bahan alam dan jenis-jenis reaksi yang dialaminya serta bagaimana cara mendapatkan senyawa yang dihasilkan dalam jumlah yang banyak. Setelah diketahui  cara mendapatkan senyawa tersebut kemudian dilakukan isolasi. Metode isolasi digunakan untuk mengekstrak sampel/senyawa bahan alam dengan menggunakan pelarut tertentu, agar diperoleh ekstrak murni yang selanjutnya dapat ditentukan strukturnya. Penentuan struktur diperoleh dari hasil metode isolasi, hasil isolasi di analisis dengan kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi kolom atau PTLC, kemudian diperiksa dengan spektoskopi (IR, UV-VIS dan NMR), HPLC dan di analisis ikatan-ikatan yang muncul pada daerah serapan berdasarkan spektoskopinya sehingga diperoleh struktur dari suatu sampel yang diperiksa.

Contoh :

Biosintesis Quercetin

Isolasi Quercetin dari Citrullus colocynthis

·         Secara in vivo

Batang, daun, buah dan akar dari Citrullus colocynthis dikumpulkan lalu dikeringkan menjadi bubuk dan digunakan untuk ekstraksi bersama dengan sampel jaringan in vitro.

·         Secara in vitro

Enam minggu jaringan kalus tua dari Citrullus colocynthis ditumbuhkan pada media MS dilengkapi dengan BAP (2,0 mg/l) dan NAA (2,0 mg/l) dikeringkan dalam oven pada 100 °C selama 15 menit dan dibuat bubuk yang digunakan untuk ekstraksi. dan digunakan untuk ekstraksi.

Prosedur Ekstraksi

Sampel kering yang terpisah diestraksi soxhlet dengan menggunakan pelarut metanol 80% (100 ml /gm berat kering) pada penangas air selama 24 jam. Masing-masing dari ekstrak yang diperoleh diekstrak kembali dalam petroleum eter (40 -60 °C) (fraksi-I), etil eter (fraksi-II) dan etil asetat (fraksi-III) secara berturut-turut. Setiap langkah-langkah diulang tiga kali dalam setiap tempat. Fraksi I ditolak karena didalamnya terdapat kandungan kaya zat lemak sedangkan fraksi II merupakan flavonoid yang bebas dari masing-masing sampel. Fraksi III dari sampel diuji melalui hidrolisis dengan direfluks menggunakan 7% H2SO4 (10 ml/gm residu) selama 5 jam. Campuran disaring dan filtratnya diekstraksi dengan etil asetat dalam corong pisah. Lapisan etil asetat dicuci dengan air suling sampai netral dan dikeringkan dalam vakum. Diambil residu dalam jumlah sedikit dari pemisahan etanol dan kemudian diuji quercetin pada berbagai tes.

Kromatografi lapis tipis (KLT)

Disiapkan pelat TLC ukuran 20 x 20 cm yang dilapisi dengan silika gel kemudian dikeringkan pada temperatur kamar. Lalu dipanaskan pada temperatur 100 °C selama 30 menit dalam oven dan didinginkan pada suhu kamar. Dibuat garis kira-kira 1 cm diatas tepi pelat lalu ditotolkan fraksi II etil eter dan fraksi III etil asetat pada pelat TLC dengan acuan standar senyawa (quercetin). Lalu pelat tersebut dimasukkan ke gelas kimia yang berisi 200 ml campuran pelarut n-butanol, asetat asam dan air dengan perbandingan 4: 1: 5. Kemudian divisualisasikan dibawah sinar UV dan menunjukkan noda yang terpisah dengan baik pada  kedua fraksi, yaitu fraksi II dan III dalam semua hal menunjukkan noda yang sama dengan noda sampel standar quercetin.

Sebagai pembanding  pelat yang ditotolkan fraksi II etil eter dan fraksi III etil asetat yang kemudian dimasukkan kedalam gelas kimia yang berisi uap amonia untuk mengamati warna bintik-bintik kuning kuersetin dan plat yang ditotolkan fraksi II etil eter dan fraksi III etil asetat dimasukkan kedalam gelas kimia yang berisi I₂ untuk mengamati warna bintik-bintik coklat kuning dari kuersetin . Kemudian dihitung nilai Rf nya.

Noda-noda yang divisualisasikan dibawah sinar UV ditandai lalu diambil dan dikumpulkan secara terpisah bersama dengan silika gel kemudian dilarutkan dengan etanol. Setelah itu di ditambahkan kloroform sehingga membentuk kristal. Kemudian dianalisis dengan menggunakan spectrum IR dan HPLC.

Penentuan Struktur Quercetin Dengan Spektroskopi IR