Pengertian dan Jenis Marka (Penanda) Molekuler

Menurut  Semagn et al (2006), definisi marka (penanda) molekuler adalah sekuen DNA yang dapat diidentifikasi, dan terdapat pada lokasi tertent pada genom, dan dapat diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Ibaratnya sebuah barcode, keberadaan marka molekular tersebut secara prinsip memiliki perbedaan, sehingga untuk memilih dan pengaplikasian harus dengan hati-hati. Definisikan marka genetik merupakan gen yang terekspresi dan membentuk fenotip, biasanya mudah dibedakan, digunakan untuk identifikasi individu atau sel yang membawanya, atau sebagai probe untuk menandai inti, kromosom, atau lokus. 

Kemudian Recee and Haribabu (2007) berpendapat bahwa marka molekuler adalah DNA yang teridentifikasi, ditemukan pada lokasi tertentu pada genom, diwariskan dari generasi ke generasi berukutnya dengan mengikuti  hukum pewarisan sifat. Sehingga dari beberapa pengertian tersebut dapat disimpulakan pengertian Marker molekular merupakan sekuen DNA yang teridentifikasi pada genom dan dapat diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya dengan mengikuti hukum pewarisan sifat.

Marker molekular dapat dinggap sebagai bagian yang tidak mudah mengalami perubahan akibat aktifitas genetik seperti mutasi dan insersi atau proses seleksi alam. Sehingga pada proses evolusi daerah tersebutlah yang tetap akan diwariskan oleh ancestor (leluhur) kepada keturunan berikutnya.  Marka molekular memiliki beberapa kelebihan antara lain:

1. Marka molekular tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan yang sangat bervariasi sehingga marka molekular merupakan daerah yang conserve. 
2. Marka molekular terdapat pada semua genom, sehingga banyak ditemukan pada semua genom individu yang akan dilihat polimorfismenya. 
3. Marka molekular sangat conserve sehingga perubahan yang terjadi sangatlah sedikit, maka dapat dijadikan penanda bahwa organisme tersebut masih dalam satu kelompok atau tidak dilihat dari marke tersebut. 

Marker molekular pada aplikasinya sangatlah beragam, sehingga untuk memilih Marka molekular harus disesuaikan dengan organisme yang akan diteliti dan pada DNA mana yang akan dianalisis sekuennya. Marker molekular dapat diaplikasikan pada beberapa genom DNA yang terdapat pada nukleus, mitokondria, kloroplas, atau organel lain (Recee and Haribabu, 2007).

Menurut Varma (2011) pemilihan marka berdasarkan atas mode pewarisan, sensitivitas, perbandingan terhadap suatu masalah, dan reprodusibilitas. Marka molekular dibagi atas marka dominan dan marka kodominan. Marka ko-dominan adalah salah satu marka yang dapat mengidentifikasi semua alel yang ada pada suatu lokus tertentu, sedangkan marker dominan hanya mengungkap alel dominan tunggal saja tetapi pada lokus yang sama. Data ko-dominan umumnya lebih tepat daripada data dominan tetapi marka dominan biasanya membutuhkan waktu lebih cepat dan lebih mudah mendapatkan data.  Macam-macam  marka (penanda) molekular yang sering digunakan yakni marka mtDNA, single nucleotide polymorphisms (SNPs), allozyme, restriction fragment length polymorphisms (RFLPs), microsatellite atau simple sequence repeats (SSRs), random amplified polimorphic DNA (RAPD), dan amplified fragment length polymorphisms (AFLPs). Berikut adalah penjelasan jenis marka (penanda) molekuler beserta penjelasan:

1. Marka Molekuler mtDNA

Polimorfisme DNA mitokondria (mtDNA) digunakan dalam filogenetik dan analisis diversitas genetik. Haploid mtDNA dibawakan oleh mitokondria di dalam sitoplasma, pewarisan maternal dan laju mutasi yang tinggi. Polimorfisme dalam urutan daerah hipervariabel dari D-loop atau kontrol daerah mtDNA telah memberikan kontribusi besar terhadap identifikasi nenek moyang liar dari spesies domestik, pembentukan pola geografis keanekaragaman genetik, dan pemahaman domestikasi ternak. 

Adanya mtDNA dapat menggambarkan bahwa perkembangan sekuens DNA yang informatif mampu menjawab level populasi. Marka ini digunakan untuk mempelajari filogeografi intraspesifik yang fokus pada pola hasil variasi dari salah satu sejarah atau barrier untuk aliran gen dalam populasi, yang diinisialkan dengan penggunaan mtDNA. Sekuens mtDNA dibatasi oleh mtDNA genom yang terdiri dari pewarisan lokus uniparental tunggal. Perluasan penggunaan marker mtDNA (Gambar 1) yaitu marka ribosomal DNA (12S rDNA dan 16S rDNA), marka pengkode gen protein (antara lain: cytochrome b, cytochrome oksidase subunit I dan II, NADH dehydrogenase subunit), dan kontrol region marker.

Gambar 1. Marka molekuler mtDNA.

2. Marka Molekuler Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)

Marka ini merupakan mutasi titik dimana satu nukleotida disubstitusi oleh nukleotida lain pada lokus tertentu. SNP merupakan tipe yang lebih umum untuk membedakan sekuen diantara alel, kodominan di alam, dan menandakan marka polimorfik dari suatu sumber yang tidak pernah habis untuk penggunannya pada resolusi tinggi dalam pemetaan genetik suatu karakter (Gambar 2). Deteksi marka SNP bersifat kodominan, hal ini didasarkan pada amplifikasi primer yang memiliki basis pada informasi sekuen untuk gen yang lebih spesifik. Kelebihan dari teknik SNP adalah lebih mudah diterapkan jika dibandingkan dengan teknik SSR maupun AFLP. Selain itu kelebihannya adalah lebih berguna pada beberapa lokus SNP yang memiliki posisi yang sangat berdekatan yang dapat mendefinisikan adanya haplotipe dan pengembangan haplotype tags. Kekurangan marka molekuler SNP adalah membutuhkan informasi sekuen genetik untuk suatu gen yang menjadi target analisis serta membutuhkan pengadaan alat dan bahan yang membutuhkan biaya tinggi (Azrai, 2005).

Gambar 2. Informasi urutan DNA untuk identifikasi SNP pada tingkat variasi individu dengan spesies yang sama. 

3. Marka Molekuler Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs)
Marka (penanda) molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) adalah marka (penanda) ko-dominan, sangat dapat dipercaya dalam analisis linkage dan breeding serta dapat ditentukan dengan mudah jika karakter terdapat dalam bentuk homozigot atau heterozigot. Keunggulan dari marka RFLP (Gambar 3) adalah konsistensi yang tinggi, sifat pewarisan ko-dominan, dapat diulang antar laboratorium, memberikan marka pada lokus yang spesifik, tidak memerlukan informasi sekuen, dan relatife mudah dilakukan scoring karena adanya perbedaan yang cukup besar antar fragmen. Akan tetapi penerapan RFLP memerlukan DNA dalam jumlah yang cukup besar untuk proses pemotongan dengan enzim restriksi. Selain itu, penggunaan digunakan isotop radioaktif dengan harga yang relatif mahal serta berbahaya, dan waktu yang diperlukan untuk pengujian juga cukup lama (Varma, 2011).

Gambar 3. Proses pemotongan urutan DNA dengan enzim restriksi berdasarkan marka molekuler RFLP. 

Keterbatasan RFLP dikarenakan beberapa faktor (1) pada beberapa spesies tingkat polimorfisme DNA-nya sangat rendah, (2) menyita banyak tenaga dan waktu, (3) kuantitas dan kualitas DNA yang diperlukan sangat tinggi, (4) prosedur hibridisasinya rumit sehingga menyulitkan otomatisasi, dan (5) membutuhkan koleksi probe untuk spesies yang belum pernah dieksplorasi sebelumnya.

4. Marka Molekuler Mikrosatelit atau Simple Sequence Repeats (SSRs)
Marka mikrosatelit yang juga dikenal dengan Simple Sequence Repeats (SSRs) adalah kelas terkecil dari sekuen berulang (Gambar 4). Marka molekuler SSR adalah salah satu marka yang telah dikembangkan pada komoditas tanaman pangan dan perkebunan, marka molekuler ini telah dibuktikan memiliki keefektifan yang baik untuk proses pengorganisasian meteri genetik berdasarkan jarak genetik serta pemetaan gen. Pada saat ini SSRs merupakan marka yang banyak dipilih oleh peneliti genetika molekuler karena sifatnya sangat polimorfik bahkan untuk spesies maupun galur yang memiliki hubungan kekerabatan yang dekat; membutuhkan DNA dalam jumlah kecil; dan dapat dilakukan secara otomatis.

Gambar 4. Contoh urutan sekuens (urutan) DNA pada mikrosatelit tanaman.

Kelebihan dari marka SSRs yakni:

1. Metode yang digunakan relatif sederhana serta dapat dikerjakan secara otomatis.
2. Memiliki marka yang kebanyakan monolokus serta mengikuti sistem hereditas Hukum Mendel.
3. Terdapat kandungan informasi yang lebih mendalam.
4. Melimpahnya pasangan primer SSR yang cukup banyak di pasaran. 
5. Biaya lebih efesien pergenotipe dan primernya.

5. Marka Molekuler Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Penjelasan mengenai RADP secara khusus dan lengkap ada di dalam tulisan berikut:
Penanda Molekuler RAPD


6. Marka Molekuler Amplified Fragment Length Polymorphisms (AFLPs)
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) adalah marka molekuler yang didasarkan adanya amplifikasi yang selektif yang berasal dari potongan DNA. Potongan tersebut merupakan hasil restriksi dari total suatu genom dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease (Gambar 5). Hasil amplifikasi tersebut kemudian dipisahkan dengan metode elektroforesis dan selanjutnya dianalisis dengan menggunakan otoradiografi atau pewarnaan perak. Marka molekuler AFLP dapat dikategorikan sebagai marka kodominan meskipun pada seringkali dianggap sebagai marka dominan. Hal tersenut dikarenakan adanya kesulitan dalam membedakan intensitas pita hasil analisis antara dominan homozigot dan heterozigot.

Gambar 5. Prosedur AFLP.